Куриный эмбрион


В тканях эмбриона, его оболочках, желточном мешке способны размножаться многие патогенные вирусы человека и животных. При этом имеет значение избирательность вирусов к той или иной ткани: вирусы группы оспы хорошо репродуцируются и накапливаются в клетках хорион-аллантоисной оболочки, вирус паротита – в амнионе, вирусы гриппа – в амнионе и аллантоисе, вирус бешенства – в желточном мешке. Строение 12-дневного куриного эмбриона представлено на рисунке 2.

Куриный эмбрион

 

1 – эмбрион; 2 – хорион-аллантоисная оболочка; 3 – аллантоисная полость; 4 – амниотическая полость; 5 – белок; 6 – экстраэмбриональная полость; 7 – желточный мешок; 8 – воздушная полость.


Рисунок 2 –Строение 12-дневного куриного эмбриона

 

Метод культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах имеет ряд преимуществ перед другими методами:

· плотная скорлупа довольно надежно защищает внутреннее содержимое от микроорганизмов;

· эмбрионы не имеют антител и восприимчивы ко многим группам вирусов;

· при заражении куриных эмбрионов получают больший, чем при других методах культивирования, выход вируссодержащего материала;

· метод заражения куриных эмбрионов прост и доступен любым вирусологическим лабораториям, эмбрионы обладают достаточной жизнеспособностью и устойчивостью к возбудителям внешних факторов.

Однако куриные эмбрионы не всегда свободны от латентных вирусных и бактериальных инфекций. Трудно наблюдать за динамикой патологических изменений, происходящих в эмбрионе после заражения его вирусом. При вскрытии зараженных эмбрионов часто не обнаруживают видимых изменений и выявляют вирус с помощью реакции гемагглютинации и другими методами. В зараженных эмбрионах невозможно проследить за нарастанием титра антител. Метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов.

Для вирусологических исследований используют эмбрионы 7-12-дневного возраста, которые получают из птицеводческих хозяйств. Можно выращивать эмбрионы в обычном термостате, на дно которого ставят лотки с водой для увлажнения воздуха. Температура в термостате должна быть 37 °С, а влажность воздуха – от 60 % до 65 %.


бирают крупные, чистые (но немытые), оплодотворенные яйца от белых кур, хранившиеся не более 10 суток при температуре от 5 °С до 10 °С. Оплодотворенные яйца распознают по наличию зародышевого диска, который при просвечивании с помощью овоскопа имеет вид темного пятнышка. В термостате яйца содержат на специальных деревянных или металлических подставках, имеющих несколько рядов отверстий размером от 3,5 до 4 см. В процессе инкубации яйца следует ежедневно выносить из термостата на время от 20 до 30 мин для проветривания и периодически просматривать их в затемненной комнате под овоскопом с целью контроля за развитием эмбриона.

При работе с вирусами могут быть использованы различные методы заражения эмбрионов, но наибольшее практическое применение получили нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, введение в аллантоисную, амниотическую полости и желточный мешок (рисунок 3). Выбор метода зависит от биологических свойств изучаемого вируса. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона на овоскопе. Живые эмбрионы подвижны, хорошо видна пульсация сосудов оболочек. При овоскопировании отмечают простым карандашом на скорлупе границы воздушного мешка или место расположения эмбриона, которое определяют по его тени на скорлупе.

Куриные эмбрионы заражают в боксе в строго асептических условиях, используя инструменты, стерилизованные кипячением. При любом методе заражения скорлупу над воздушным пространством прожигают на огне, затем смазывают 2 % йодной настойкой, снова протирают спиртом и обжигают.


Куриный эмбрион

Источник: studopedia.info

Для понимания различных процессов на разных уровнях организации, биологических функций и структур используют модельные объекты. Существует несколько видов моделей: химические, биологические, физико-химические. Вирусология — наука, изучающая природу вирусов, особенности химического состава, морфологии, механизмов размножения и генетики. Одним из основных модельных объектов в вирусологии является куриный эмбрион. Куриные эмбрионы вошли в вирусологическую практику в 30-х годах ХХ века.

Куриный эмбрион представляет собой зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. Яйцо с развивающимся куриным эмбрионом покрыто снаружи твёрдой скорлупой, к которой плотно прилегает подскорлупная оболочка. Подскорлупная оболочка разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш окружён околоплодной жидкостью, заполняющей амниотическую полость, и пуповиной связан с желтком. Желток располагается немного в сторону от центра и относительно зародыша по другую сторону продольной оси. Под подскорлупной оболочкой находится аллантоидная полость, покрывающая амнион и желточный мешок. В процессе развития аллантоидная оболочка срастается с хорионом, образуя единую хорионаллантоисную оболочку (ХАО). В остром конце яйца находится остаток белка(см. рисунок 1).


Рис 1. Строение куриного эмбриона.

В лабораторных условиях эмбрионы содержат в термостате при температуре 37oC и влажности 60-70%. Качество яйца оценивается несколькими признаками: его размером, состоянием скорлупы, правильностью формы. При предынкубационном отборе отбраковываются крупные (свыше 65-70 г) и мелкие (45-47 г) яйца. Слишком крупные разбиваются во время инкубации, из мелких выводятся цыплята с пониженной жизнеспособностью и малой массы. К инкубации яйца с загрязненной скорлупой не допускаются. Скорлупная оболочка должна быть гладкой, матового тона, что свидетельствует о свежести яйца и целостности скорлупы. Яйца с тёмными пятнами не допускаются к исследованию, так как их наличие указывает на развитие микроорганизмов. Используются куриные эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации. Эмбрионы размещают воздушной камерой вверх в штативах, вентиляционные отверстия должны быть открыты.

Подготовка куриных эмбрионов к заражению состоит из нескольких этапов: подготовку рабочего места, дезинфекцию скорлупы, овоскопирование.

Овоскопирование — просмотр яиц против яркого источника света, на неосвещенной стороне скорлупы образуются тени от внутренних структур.


скорлупной оболочке карандашом отмечают 3 участка: границу воздушной камеры, бессосудистую зоны размером 0,5 х 0,5 см и место расположения зародыша. В дальнейшем отметки используют в качестве ориентира при выборе места введения вируссодержащего материала. Также на этом этапе определяют погиб или жив зародыш посредством его активных движений. Заражение проводят в асептических условиях. В предбокснике скорлупную оболочку обеззараживают йодированным спиртом, затем в боксе повторно протирают, и иногда обрабатывают пламенем смоченного спиртом тампоном.

Существуют несколько методов заражения эмбрионов. Выбор метода определяется видом вируса, целью заражения. При заражении вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала.

Заражение в аллантоидную полость. При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы ринопневмании лошадей, гриппа, везикулярного стоматита и др. Куриный эмбрион располагают вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу с вирус содержащим материалом вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм. (см. рисунок 2) После инъекции её извлекают, а отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным стерильным парафином.

Рис 2. Заражение в аллантоидную полость.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод используется при культивировании чумы плотоядных, катаральной лихорадки овец и др. Эмбрион фиксируют в штатив вертикально тупым концом вверх, и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают отверстие диаметром 15-20мм(см. рисунок3). Пинцетом снимают подскорлупную оболочку, на обнажившийся участок ХАО вводят 0,2 мм вирус содержащей суспензии, отверстие закрывают лейкопластырем или покровным стеклом, укрепив его парафином.


Рис. 3. Заражение на хорионаллантоисную оболочку.

Заражение в желточный мешок. Этот метод используется для размножения катаральной лихорадки овец, хламидий, ринопневмонии лошадей и др. Эмбрионы закрепляют в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45 к вертикальной оси, (см. рисунок 4)

Рис 4. Заражение в желточный мешок.

В вирусологии существуют несколько признаков размножения вируса в курином эмбрионе. Одним из главных может служить гибель эмбрион в характерные для данного вируса сроки. Следующим признаком является патологоанатомические изменения, появляющиеся в различных структурах эмбриона (например, хорионаллантоисная оболочка может иметь кровоизлияния, узелки, может быть отечной). Существуют вирусы, которые, размножаясь в эмбрионах, не вызывают ни патологоанатомических изменений, ни гибели (например, вирус ньюкаслской болезни) Выявить такой вирус можно с помощью реакции гемагглютинации.

Гибель зародыша в течение первых 24 часов после инфицирования обусловлена размножением бактериальной микрофлоры, грибов или повреждением при заражении. Эмбрионы инкубируют до максимального накопления вируса. Срок инкубации является определенным и варьирует в пределах от 2 до 8 суток. Полученные образцы умерщвляют охлаждением при 4 в течение 3-4 ч и вскрывают.


Вскрывают куриные эмбрионы, с целью получения вируссодержащего материла, обнаружения признаков размножения вирусов. Все эти процессы требуют правила асептики при вскрытии. В зависимости от того, каким вирусом был заражен куриный эмбрион, вируссодержащим материалом могут быть: желточный мешок (его стенки), ткани зародыша, амниотическая жидкость и др. Перед вскрытием скорлупу эмбриона обрабатывают йодированным спиртом. Вскрытие совершают в боксе, используя стерильную посуду и инструменты. Скорлупу срезают над воздушной камерой, яйцо должны держать под определенным углом, чтобы скорлупа не упала. Инструменты не должны повреждать оболочку, лежащую под воздушной камерой. При вскрытии эмбрионов ставят бактериологический контроль вируссодержащего материала посевом на МППБ, МПБ, МПА. Материал хранят при температуре — 26oС и ниже.

Использование куриного эмбриона дало возможность успешнее решать задачи, стоящие перед вирусологией, в связи с тем, что имеют ряд преимуществ перед лабораторными животными:

1) относительно высокая чувствительность к широкому спектру вирусов;

2)скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от заражения со стороны внешней среды;

3) легкодоступный объект в связи с развитием инкубаториев и птицефабрик;

4) не требуют кормления и ухода.

Источник: scienceforum.ru

1


  • Авторы
  • Резюме
  • Файлы
  • Ключевые слова
  • Литература

Механизмы, обеспечивающие выживаемость клеток и их подвижность в процессе эмбриогенеза, во многом совпадают с механизмами канцерогенеза и метастазирования. Определение генов и факторов транскрипции, регулирующих эпителиально-мезенхимальное перемещение, облегчило понимание механизмов гаструляции, миграции клеток нервного гребня и, в итоге, метастазирования [5]. Это доказывает возможность применения куриных эмбрионов в качестве моделей для исследований: как в области эмбриологии, так и онкологии. Куриный эмбрион – уникальная модель, которая позволяет обойти многие ограничения при изучении канцерогенеза in vivo. Доступность хориоаллантоисной мембраны, хорошо васкуляризованной экстарэмбриональной ткани, расположенной под скорлупой и толерантной к ксеротрансплантатам опухолевых клеток, делают ее удобным объектом для проведения экспериментальных исследований. Этим объясняется давняя история успешного применения хориоаллантоисной мембраны в качестве биологической платформы для изучения молекулярных механизмов опухолевого роста, включая метаплазию, вирусный канцерогенез, реакции на ксенотрансплантацию опухолевых клеток, ангиогенез и метастазирование [10].


скольку куриный эмбрион является иммунодефицитным, на хориоаллантоисной мембране хорошо приживаются как нормальные, так и опухолевые клетки [10]. Важно то, что на хориоаллантоисной мембране опухолевые клетки сохраняют основные свойства, в том числе способность к росту, инвазии, ангиогенезу и перестройке соседних структур. В связи с этим, данный объект является исключительно удобной моделью для изучения молекулярных механизмов опухолевого роста [1, 10].

Миграция опухолевых клеток и метастазирование

За последние годы особое внимание уделялось механизмам миграции опухолевых клеток и ее роли в метастазировании [9]. Хориоаллантоисная мембрана успешно адаптирована в качестве модели для количественного анализа ключевых этапов метастатического процесса с использованием видоспецифичных и количественных Alu-ПЦР для обнаружения диссеминированных опухолевых клеток человека во вторичных тканях [10]. Выявление диссеминированных клеток с помощью Alu-ПЦР делает возможным количественную оценку метастазирования в органы, колонизированные не менее, чем 25 клетками [9, 10, 12]. Такой подход был использован для демонстрации роли матриксных металлопротеиназ в ходе метастазирования и позволил количественно выявить среди опухолевых клеток их типы с различной способностью к метастазированию.


еди матриксных металлопротеиназ, идентифицированных в хориоаллантоисной мембране с культивируемой на ней тканью, куриная ММП-13 (кММП-13) была единственным ферментом, индукция и экспрессия которого кореллировала с началом ангиогенеза и формированием кровеносных сосудов. кДНК кММП-13 была клонирована и рекомбинантно экспрессирована. Белок кММП-13 был очищен, изучен in vitro, и испытан in situ на коллагене выращиваемой ткани. ММП-13-позитивные клетки появляются в хориоаллантоисной мембране вскоре после стимуляции ангиогенами культивируемой ткани. Морфологически, клетки содержащие кММП-13, представляют из себя гемопоэтические клетки моноцитарного/макрофагального ряда. In vitro, кММП-13-проэнзим быстро и эффективно активировался каскадом урокиназный активатор плазминогена – плазминоген – плазмин с образованием коллагеназы, способной расщеплять нормальный, но не мутантный коллагеназо-резистентный коллаген. Нанограммы очищенного кММП-13 вызывали в клеточных культурах на хориоаллантоисной мембране ангиогенез сопоставимый с вызванным сосудистыми факторами роста. Это свойство кММП-13 эффективно блокируется селективными ингибиторами протеаз, что говорит о том, что кММП-13 in vivo играет определенную роль в качестве фактора ангиогенеза.

Zijlstra и соавт. разработали высокочувствительный метод мониторинга метастатической диссеминации опухолевых клеток в курином эмбрионе, который далее был использован для сравнительной оценки этапов метастатического каскада двух злокачественных клеточных линий, HEp3 и HT1080. При помощи alu-ПЦР было выявлено, что спонтанное метастазирование линии HEp3 происходит с высокой скоростью и эффективностью. За 7 дней число злокачественных клеток в опухоли составляет 1-2×104/легкое. Напротив, скорость метастазирования линии HT1080 в 50-100 раз ниже, и через неделю количество клеток находится в диапазоне 200-400/легкое. При этом, сравнение процесса образования метастазов этими клеточными линиями позволяет объяснить более медленное метастазирование HT1080 двумя отчетливыми факторами: в 8-10 более низкий уровень интравазациии в этой линии и более позднее начало роста во вторичном органе [10].

Также эта стратегия использовалась для определения роли в метастазировании скаффолд-белка CD151, регулирующего подвижность опухолевых клеток [12]. Для изучения последствий нарушения подвижности опухолевых клеток разработан ряд новых методик с использованием эмбрионов птиц [4, 6, 12]. Микроскопическая оценка опухолевых клеток в хориоаллантоисной мембране показала наличие чрезвычайно динамичной клеточной среды, в которой опухолевые клетки активно продвигались через опухолевую ткань и прилегающую строму [12]. При изучении картины иммобилизации, вызванной ингибитором метастазирования – антителами к CD151 – было выявлено, что клетки стали неспособны к отсоединению от первичной опухоли, что лишало их способности к передвижению, интравазации и метастазированию [12]. Визуализация in vivo также выявила значительное влияние внеопухолевых сосудистых и стромальных клеток куриных эмбрионов на миграцию клеток опухоли [7].

Исследование роли гемодинамики и ангиогенеза при опухолевом росте

Сосудистое снабжение нормальных тканей или новообразований необходимо для их выживания, и потому куриные эмбрионы сыграли немалую роль в ранних описаниях кровеносной системы позвоночных сделанным Уильямом Гарвеем и Марчелло Мальпиги. Сосуды развивающегося цыпленка и экстраэмбриональные оболочки легко определяемы, а поверхностное расположение делает их удобными для наблюдения и проведения манипуляций. Изучение in ovo ангиогенеза, вызванного опухолевым ростом, началось в 20 веке на хориоаллантоисной мембране, и на ранних этапах визуализация продолжала осуществляться в яйце. С современными неинвазивными, in vivo моделями [12] на куриных эмбрионах возможен мониторинг процессов неоваскуляризации in vivo. Особый класс вирусных наночастиц позволяет визуализировать образовавшиеся сосуды в растущей опухоли и проводить мониторинг целенаправленной доставки веществ в опухоль на хориоаллантоисной мембране [4]. Этот подход к всесторонней оценке неоплазии становится стандартом для изучения как молекулярных процессов, лежащих в основе опухолей, так и возможных методов лечения [2].

Когда развивающийся эмбрион извлекается из яйца и выращивается ex ovo, хориоаллантоисная мембрана оказывается растянутой на поверхности белка и желтка, открывая доступ к своей сосудистой сети, благодаря чему она становится удобной платформой для проведения длительных экспериментов [7]. Чрезвычайно удобный доступ к сосудам был оценен многими экспериментаторами. Работы, проведенные на хориоаллантоисной мембране, выявили потребность опухоли в неоваскуляризации и продемонстрировали, что ингибиторы ангиогенеза способны блокировать ее рост. На данной модели были открыты ингибиторы ангиогенеза грибкового происхождения, а также показано, что эндостатин, выделяемый во время протеолитической реорганизации внеклеточного матрикса, является фактором, угнетающим сосудистый рост [8]. Известно, что для стимуляции ангиогенеза опухоли активируют продукцию ряда ангиогенных факторов, включая факторы роста фибробластов (aFGF and bFGF), а также сосудистого эндотелального фактора роста (VEGF). Однако, многие злокачественные опухоли также выделяют ингибиторы ангиогенеза, в том числе ангиостатин и тромбоспондин. Отсюда понятно, что ангиогенный фенотип – это результат  дисбаланса между положительными и отрицательными регуляторами ангиогенеза [8].

Были выявлены гемопоэтические клетки, выделяющие матриксные металлопротеиназы MMP9 и MMP13, необходимые для реорганизации матрикса во время ангиогенеза [11].

Современные технологические достижения в области систем визуализации позволили наблюдать за ходом васкуляризации хориоаллантоисной мембраны и четко выделить стадии ангиогенеза [6, 7]. Новые контрастные препараты являются селективными в отношении развивающихся сосудов, что позволяет увидеть специфические структуры на микроскопическом уровне [6, 7]. Поскольку опухоли хорошо растут на поверхности хориоаллантоисной мембраны и индуцируют рост ее сосудов, это удобная модель для визуализации кровотока in vivo в режиме реального времени. Высокое разрешение при этом позволяет выявить ток жидкости и динамику распространения молекул в новообразовании [4]. Lewis и др. разработали методику, суть которой заключается в использовании вирусных наночастиц в качестве платформы для наблюдения ангиогенеза в хориаллантоисной мембране. Биодоступный вирус мозаики коровьего гороха, меченый флуоресцентным красителем, позволяет получить яркие наночастицы со способностью дисперсии in vivo, благодаря чему возможна визуализация эндотелия в период не ранее 72 часов. При этом глубина расположения сосудов, доступных исследователю при использовании данного метода, составляет до 500 мкм [7]. Наблюдение за тем, как наночастицы проходят через сосуды, питающие опухоль, позволяет прогнозировать, каким образом вводимые в сосудистое русло препараты будут распределяться в опухоли и окружающих тканях. Технология создания микроскопических слепков также позволяет осуществлять контроль за неоваскуляризацией. Визуализация динамики образования сосудов опухоли на хориоаллантоисной мемране – более быстрый, простой и дешевый способ в сравнении с использованием в качестве объекта исследования млекопитающих, что оправдывает возможность их использования для скрининга лекарств и разработки средств их селективной доставки. Последние, будучи связанными с терапевтическими препаратами, делают их более специфичными в отношении опухолевых клеток [1, 2, 12]. Bobek и др. было изучено влияние комбинации стрептокиназы и гемцитабина на метастазирование карциномы Льюиса. Клетки опухоли, стабильно экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), были добавлены в куриные эмбрионы на 12 сутки периода инкубации. Через 7 дней с помощью флуоресценции метастазы карциномы Льюиса были обнаружены в головном мозге развивающегося эмбриона, сердце и грудине, с наибольшим их количеством в мозге. Аналогичный опыт провели с одновременным добавлением стрептокиназы и гемцитабина по отдельности и в комбинации. Комбинация гемцитабин-стрептокиназа угнетала метастазирование во все указанные органы [1].

Куриный эмбрион как модель для исследования меланомы

Первичная кожная меланома непосредственно не является причиной летального исходу, поскольку основные поражения внутренних органов и смерть, обусловлены ее метастазами. Поскольку изучение клеток меланомы in vitro в двухмерных (плоских) культурах зачастую недостаточно точно воспроизводит реальную картину опухолевого процесса, более информативны трехмерные модели, точнее моделирующие изменения в организме, происходящие во время запуска и прогрессирования неопластической трансформации [3]. Для создания трехмерной модели изучения механизмов миграции и инвазии клеток меланомы in vitro возможно использование куриных эмбрионов. После трансплантации клеток меланомы, происходящих из нервного гребня, в нервную трубку, клетки продолжают миграцию в медиальном и латеральном направлениях и, в итоге, подвергаются апоптозу в определенных зонах. При встраивании в эктопические зоны, такие, как область ромбовидного мозга или ямки диска зрительного нерва, происходит злокачественная инвазия опухолевых клеток и тканевая деструкция. В противоположность данному явлению, меланоциты не способны к спонтанному продолжению миграции клеток нервного гребня. Злокачественная инвазия меланоцитов может быть индуцирована предварительной обработкой трансформирующим ростовым фактором бета из семейства bmp-2 [3]. Трансплантация клеток рака молочной железы MCF7 имеет иной образец роста в ромбовидном мозге, нежели клетки меланомы. Модель культивирования клеток меланомы на курином эмбрионе является легко осуществимой, бюджетной платформой для изучения особенностей инвазии опухолевых клеток в эмбриональных тканях. Это может быть полезно для исследования инвазивных свойств клеток, индуцированных эмбриональными онкогенами, а также для разработки методик воздействия на опухолевые клетки с целью устранения их инвазивных свойств.


Библиографическая ссылка

Лысов Е.Е., Минина Я.И., Певзнер Д.А., Лазарев В.В., Конев С.С., Погосян С.А., Трофименко А.И. КУРИНЫЙ ЭМБРИОН КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КАНЦЕРОГЕНЕЗА // Международный студенческий научный вестник. – 2018. – № 1.;
URL: http://eduherald.ru/ru/article/view?id=18100 (дата обращения: 15.08.2019).

Источник: eduherald.ru

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — «золотой стандарт» в диагностике вирусных инфекций.

Культуры клеток

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каж­дому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвест­ного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соот­ветствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и живот­ных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плос­кую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.

Первично-трипсинизированные культуры.Суспензии клеток получают гомогенизиро­ванием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клетокпредставлены диплоидными клетками человека и живот­ных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтан­ной трансформации.

Перевиваемые линии клеток(гетероплоидные культуры) представлены клетками, подверг­нутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравне­нию с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Культуры органов

Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживаю­щей ткани.

 

Куриные эмбрионы (рис. 1-20)— практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.



Заражение на хорион-аллантоисную мембрану.Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобож­дают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают от­верстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, сво­бодный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обрабо­танный бактерицидами).

Куриный эмбрион

Заражение в амниотическую полость.Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.

Заражение в аллантоисную по­лость.10-суточные эмбрионы зара­жают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).

Заражение в желточный мешок.Используют 3~8-суточные эмбрио­ны, у которых в этом возрасте жел­точный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воз­душном мешке

Наблюдение и учёт результатов.В качестве вируссодержащего материала можно исполь­зовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими

тканями на кусочки. Для выявления Рис. 1-20.Схематическое изображение

характер­ных поражений на хорион- развивающегося куриного эмбриона.

аллантоисной мембране удаляют скорлупу

и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.

Животные модели

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Источник: studopedia.su

Перед заражением КЭ скорлупа на месте вскрытия или инъекции об­рабатывается спиртом, обжигается, затем обрабатывается 5% раствором йода и вновь обжигается. Можно обрабатывать йодированным спиртом. Только после этого делаем прокол или вскрытие скорлупы. Методов за­ражения КЭ много, основные из них следующие:

1. Заражение на хорион- аллантоисную оболочку. КЭ должен быть 7-10 дневного возраста. На хорион-аллантоисной оболочке можно культивировать вирусы оспы, ящура. Доза заражения — 0,1 мл. Имеются три метода заражения на хорионаллантоисную оболочку:

А. Со стороны пути. Ножницами вскрывают пугу, иглой или пинцетом отпрепаровываем второй листок подскорлуповой оболочки в месте хорошо развитых кровеносных сосудов, наносим вирусосодержащий материал и тем же листком прикрываем. Окошечко в скорлупе закрывается покровным стеклом (или мелким часовым стеклом) и заливаем парафином.

Б. На границе пуги выпиливается скорлупа — 5x5x5 мм, отпрепаровывается подскорлуповая оболочка, а затем все также как в пункте «а».

С. Окошечко делается сбоку против зародыша. В этом случае ино­гда надо делать противоотверстие со стороны пуги и с помощью груши отсасывать воздух.

2. Заражение в аллантоисную полость. Применяется чаще других. Возраст эмбриона 9-11 дней. Доза заражения — 0,1 мл. Можно культивировать вирус гриппа, чумы птиц, чумы собак, инфлуэнцы. Существует два способа.

А. Через пугу. Делаем отверстие для иглы. Иглу погружаем настоль­ко, чтобы попасть в аллантоисную полость. После введения вируссодержащего материала отверстие закрываем расплавленным парафином.

Б. Против предлежания К.Э. Яйцо фиксируем крестиком вверх, отступив от крестика 2-3 мм вверх делаем прокол иглой приблизительно на 0,5 см. Отверстие закрываем парафином.

3. Заражение в амниотическую полость. Возраст эмбриона 9-11 дней. Доза заражения — 0,1 мл. Существует два способа.

А. Через пугу. Делаем отверстие для иглы. Иглу погружаем настоль­ко, чтобы попасть в амниотическую полость. После введения вируссодержащего материала отверстие закрываем расплавленным парафином.

Б. Против предлежания К.Э. Яйцо фиксируем крестиком вверх, отступив от крестика 2-3 мм вверх делаем прокол иглой приблизительно на 1,5 см. Отверстие закрываем парафином.

3. В желточный мешок. В этом случае используют 5-7 дневные эмбрионы. Доза заражения 0,5-1,0 мл. Применяют при орнитозе, пситтакозе, энцефалитах, риккетсиозах, бруцелле­зе. Существует два способа.

А. Яйцо фиксируется крестиком вниз, сверху в центре яйца делает­ся прокол скорлупы и вводится игла на 1,5-2 см, чтобы попасть в желточный мешок. Отверстие закрывается парафином.

Б. Яйцо оставляют в том же положении, прокол делают со стороны пути, иглу вводим с уклоном вверх, чтобы попасть в желточный мешок на 3-4 см. Отверстие закрывается парафином.

Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации при температуре +37°С — +38°С в процессе которой происходит культивирование вирусов.

Источник: StudFiles.net


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.